PCR - Polymerase Chain Reaction

(reazione a catena della polimerasi)

1.  Concetto di "clonazione" in Biologia

- Clonaggio molecolare, cellulare e di organismo

2. Scoperta della PCR (Kary Mullis) e concetto base

- Orientamento dei primer
- Specificità di sequenza: esempi nel linguaggio

3. Visualizzare e comprendere la reazione di PCR - Simulazione

DNALC: PCR animation

4. Impostare una reazione di PCR: parametri di progettazione dei primer

Primer "senso" ("sense primer"), "sinistro", o "basso"
Primer "antisenso" ("antisense primer"), "destro", o "alto"

Dimensioni della regione da amplificare?
* min 100 bp
* max 2-4 kb per amplificazione (OK fino a 1,5 kb)
* max 700 bp se i prodotti saranno sottoposti a sequenziamento diretto

Validità "biochimica" dei primers:
E' meglio posizionare una G oppure una C all'estremo 3' ("pinza GC", o "GC Clamp"), ed evitare una T.
Il contenuto del primer in GC dovrebbe essere del 45-55%.
La sequenza di ciascun primer non dovrebbe contenere regioni di autocomplementarità,
   per impedire che il filamento singolo del primer formi regioni a doppia elica.
La sequenza di ciascun primer non dovrebbe contenere regioni di sequenza complementare
a quella del primer stesso o dell'altro primer usato nella reazione,
   per impedire la formazione di "dimeri di primer".

Verificare la "validità biologica" dei primers tramite il servizio BLASTN
per cercare eventuali somiglianze con altre zone oltre quella attesa, nella stessa regione o nell'intero genoma.


A. PRIMO METODO: USO DEL SOFTWARE "Amplify" PER MACINTOSH
Istruzioni (date anche in fotocopia):
per Amplify 3 (fino al Mac OS X 10.6) oppure Amplify 4 (dal Mac OS X 10.7 in poi)

B. SECONDO METODO: USO DEL SOFTWARE "AmplifX"
Istruzioni (date anche in fotocopia):
per AmplifX

C. SECONDO METODO: USO DEL SOFTWARE "Primer-BLAST" VIA WEB
Istruzioni

5. DNA Sequencing 

Il sequenziamento del genoma umano:
"How to sequence a genome" - animazioni nn. 6, 7, 8 e 9
(Metodo di Sanger e sequenziamento automatico)

Visualizzazione di elettroforetogrammi:
scegliere il link Trace Archive

Cercare il nome del gene, seguito da questa espressione: and species_code="HOMO SAPIENS" (premere il pulsante "Submit" per avviare la ricerca).

Se non si trova nulla, cercare solo: species_code="HOMO SAPIENS"

Scegliere "Trace" dal Menu "Show", fare click sul pulsante "Show" e osservare gli elettroforetogrammi.