Progettazione di una coppia di primer

per la amplificazione della regione codificante

dell'mRNA del gene RPS19 (ribosomal protein S19)

SOFTWARE AmplifX

Copiare l'intera sequenza di mRNA del gene RPS19 (usare la banca dati "Gene"
per trovare la scheda del gene umano per la proteina ribosomiale S19,
quindi fare click sul link NM_001022 che rimanda alla sequenza di mRNA).
Annotare la posizione del codone di inizio e di quello di stop
(ossia i limiti della CDS, o coding sequence).

Avviare il programma AmplifX (icona rotonda sulla scrivania con una grande "A" e una provetta).
Chiudere la finestra "Test Target Sequence" (non chiudere la finestra dei primer).

Occorre fornire al programma: la Sequenza bersaglio, e i due primer possibili, quindi si può simulare la PCR.

1) Sequenza

Copia e incolla la sequenza del gene di interesse nella finestra "Sequence".

2) Primer

Per provare una coppia di primer:
copiare una sequenza di circa 25 basi posta a monte della regione da amplificare,
ossia a monte del codone di inizio.

Cliccare su "Primers" e selezionare "Design primers": si aprirà una nuova finestra denominata "Search primers".

Includere le coordinate in cui si desidera cercare i primer "forward" e "reverse", per esempio
25 basi a monte della regione da amplificare, ossia a monte del codone di inizio (primer "forward")
e 25 basi a valle della regione da amplificare, ossia a valle del codone di stop (primer "reverse").

Nel riquadro sottostante apparirà un elenco di coppie di primer.
Seleziona ciascuna coppia di primer e fai clic su "Add to primer list"
Verificare la lunghezza, la temperatura di melting e il contenuto di GC.

3) PCR

Cliccando "Run PCR" apparirà l'amplicone.

Cliccando sul frammento dell'amplicone apparirà la finestra "Infos".

Osservare i risultati.

Se si sono identificati primer adeguati mediante la simulazione con AmplifX,
controllare l'unicità della sequenza di ciascun primer rispetto all'intero genoma con il programma BLASTN.
Una descrizione di tutti i comandi è consultabile dal Menu Help.