Progettazione di una coppia di primer

per la amplificazione della regione codificante

dell'mRNA del gene RPS19 (ribosomal protein S19)

SOFTWARE AMPLIFY 4

Copiare l'intera sequenza di mRNA del gene RPS19 (usare la banca dati "Gene"
per trovare la scheda del gene umano per la proteina ribosomiale S19,
quindi fare click sul link NM_001022 che rimanda alla sequenza di mRNA).
Annotare la posizione del codone di inizio e di quello di stop
(ossia i limiti della CDS, o coding sequence).

Avviare il programma Amplify4 (icona rotonda sulla scrivania con una grande "A" rossa
e una sequenza di basi sullo sfondo azzurro).

Occorre fornire al programma: la Sequenza bersaglio, e i due primer possibili,
quindi si può simulare la PCR.

1) Sequenza

Incollare la sequenza di interesse nella sezione sinistra della finestra principale "Substrate"
(cancellando tutto ciò che c'era scritto in precedenza).
Fare click sul comando "Base" in alto a sinistra, sulla barra degli strumenti
per eliminare gli spazi ed i numeri.

2) Primer

La sezione destra della finestra principale "Substrate" è la finestra dei primer.
Per provare una coppia di primer:
copiare una sequenza di circa 25 basi posta a monte della regione da amplificare,
ossia a monte del codone di inizio.

Nella sezione destra della finestra principale "Substrate", premere il pulsante "+",
fare due clic nel campo "Sequence" ed incollare in esso la sequenza.
Scrivere il nome del primer nel campo "Name" (ad es.: "forward").

Quindi copiare una sequenza di circa 25 basi posta a valle della regione da amplificare,
ossia a valle del codone di stop.

Nella sezione destra della finestra principale "Substrate", premere il pulsante "+" in alto,
fare due clic nel campo "Sequence" ed incollare in esso la sequenza.
Scrivere il nome del primer nel campo "Name" (ad es.: "reverse").

Selezionare la riga di questo secondo primer,
ed eseguire il comando "Flip Selected Primers" dal Menu Selected.

3) PCR

Indicare al programma quali primer usare: fare clic sul box di scelta a sinistra della sequenza dei primer.

A questo punto, l'esecuzione del comando "Amplify" dal Menu PCR  simula una PCR.
Non modificare il "Base range" proposto dal programma.
Se il programma rileva la formazione di dimeri di primer,
per visualizzarli premere il pulsante "Primer Dimers" in alto a sinistra nella finestra con i risultati.

Osservare i risultati.
Il tratto che sarà amplificato appare compreso tra un triangolino blu
(la regione in cui si appaia il primer "forward")
e un triangolino rosso (la regione in cui si appaia il primer "reverse").

L'intensità del colore indica la stabilità del primer,
ossia la qualità del suo legame alla sequenza bersaglio,
che si può verificare facendo clic sui triangolini.
Lo spessore del segmento che simboleggia il tratto amplificato
è indicativo della efficienza della reazione.

Se il prodotto formato risponde a questi requisiti:
- è unico; - non si sono formati dimeri di primer,
si può procedere al passo successivo, altrimenti
cambiare la sequenza di uno o entrambi i primer tornando alla sequenza da amplificare.

E' utile anche visualizzare informazioni sul primer
disponibili nel riquadro in alto a destra nella finestra principale "Substrate"
selezionando il primer di interesse.
Se si sono identificati primer adeguati mediante la simulazione con Amplify,
controllare l'unicità della sequenza di ciascun primer rispetto all'intero genoma
con il programma BLASTN. Una descrizione di tutti i comandi è consultabile dal Menu Help.