CROMOSOMI E CARIOTIPO (2010)

Un cromosoma è una molecola di DNA che contiene l'informazione genetica di un organismo. Nell'uomo i cromosomi sono 46 molecole lineari di DNA a doppia elica. 23 molecole derivano dalla madre, 23 dal padre; per questo si dice che il corredo genetico umano è composto da 23 coppie di cromosomi.

Le molecole di DNA sono molto lunghe: se si considera che le coppie di basi nel genoma umano sono 6,4 miliardi, in media ogni cromosoma è costitutito da 139 milioni di coppie di basi, che occupano circa 4,7 cm in lunghezza, quindi la lunghezza totale dei cromosomi umani di è approssimativamente di due metri in ogni singola cellula. Per poter essere contenute in uno spazio ridotto come il nucleo cellulare, le molecole di DNA devono allora assumere una struttura compatta. A tale scopo la molecola di DNA a doppia elica si avvolge attorno a delle proteine basiche chiamate ISTONI. Esistono quattro tipi di istoni:
H1 (ricchi in lisina)
H2 (istoni intermedi)
H2b
H3 (ricchi in arginina)
H4
Gli istoni H2, H2b, H3 e H4 si dispongono a formare quattro spicchi di una torta, impilata su un'altra uguale in una struttura detta ottamero ("formato da otto parti"). Un tratto di DNA di circa 146 basi compie un doppio giro attorno all'ottamero. La molecola si avvolge ulteriormente su se stessa per diverse volte, in un processo detto spiralizzazione, aumentando cosi' di spessore mentre si riduce di lunghezza.

La massima spiralizzazione si ha durante la divisione cellulare (mitosi), mentre quando la cellula non è in mitosi il DNA viene svolto, in particolare nelle regioni che contengono geni che vengono trascritti.

Durante la divisione cellulare ogni molecola di DNA risulta quindi accuratamente ripiegata attorno ad un'impalcatura composta di proteine, formando un bastoncello visibile al microscopio ottico e intensamente colorabile: per questo si dette il nome a ciascun bastoncello di cromosoma, ossia "corpuscolo colorato", dal greco "croma" (colore) e "soma" (corpo). Poichè la cellula in mitosi ha replicato tutto il suo DNA, ciascun bastoncino si trova associato a un bastoncino che ne è la copia, avendo la stessa sequenza di basi. Per questo, quando possiamo concretamente osservare nel modo migliore i cromosomi, e cioè alla metafase, i cromosomi appaiono a forma di X: due bastoncini attaccati tra loro a livello della zona centrale. In questo stadio ogni cromosoma è quindi composto da due parti dette CROMATIDI. Poiché la molecola di DNA che compone un cromatide di un cromosoma ha la stessa sequenza della molecola di DNA che costituisce l'altro, i due cromatidi di uno stesso cromosoma sono anche detti "cromatidi fratelli".

La condensazione dei cromosomi ne facilita una ripartizione ordinata, senza pericolo di aggrovigliamento tra molecole di DNA diverse. La cellula quindi prima duplica tutto il DNA nucleare, poi lo divide tra le due cellule figlie. Pertanto solo durante le prime fasi della divisione cellulare il corredo dei cromosomi apparira' come un insieme di 46 elementi a forma di "X" (due cromatidi uniti a livello del centromero, per un totale di 92 cromatidi), mentre alla anafase i due cromatidi si separeranno e appariranno come due bastoncini singoli a forma di "I". Nel periodo che intercorre tra una divisione e l'altra il materiale genetico normale è in effetti composto, per ogni cellula somatica, da 46 cromatidi singoli, che tuttavia noi non visualizziamo perché queste 46 molecole di DNA sono despiralizzate in filamenti sottilissimi a formare la cromatina.

Si noti che la cellula, dividendosi, dimezza la quantita' del citoplasma, che viene diviso fra le due cellule figlie, ma l'informazione genetica, essendo stata prima raddoppiata e poi divisa a metà tra le due cellule figlie, rimane identica. Solo nel caso delle cellule germinali mature vi è un effettivo dimezzamento del materiale genetico, in seguito alla meiosi, perché ciascun gamete possiede 23 cromosomi in totale.

Il cariotipo di una cellula è il suo corredo, o assetto, cromosomico; la parola indica il "tipo" di assetto che si osserva nel nucleo, in greco "carion". Il cariotipo è caratteristico di ciascuna specie.
La citogenetica è una branca della genetica che ha per oggetto lo studio morfologico della struttura, della topologia e della funzione dei cromosomi.

Il momento più adatto per osservare e contare i cromosomi si presenta durante la mitosi.

SCHEMA
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/human.html

Negli organismi adulti la divisione cellulare è un fenomeno costante solo in alcuni tessuti, le cui cellule a vita breve devono essere continuamente sostituite. Le cellule soggette a rinnovamento continuo sono, tra quelle somatiche, le cellule del sangue, dell'epidermide e della mucosa intestinale, e, tra quelle germinali, gli spermatozoi.
La modalità più semplice dal punto di vista clinico è quella di studiare il cariotipo a partire dalle cellule ottenute mediante un normale prelievo di sangue. Le cellule del sangue adatte all'osservazione del cariotipo dovranno avere necessariamente il nucleo (e quindi non potranno essere i globuli rossi, o gli elementi piastrinici) e dovranno poter essere ancora capaci di entrare in mitosi, come lo sono i linfociti, uno dei tipi di globuli bianchi.

La procedura pertanto può essere così sinteticamente descritta: si separano dal sangue in provetta le cellule linfocitarie e si pongono in coltura con un terreno nutritivo in un adatto incubatore, alla temperatura di 37°C. In queste condizioni le cellule possono continuare a vivere all'esterno dell'organismo. Si induce quindi la divisione cellulare aggiungendo una sostanza detta "fitoemoagglutinina", in inglese "PhitoHemoAgglutinin" (sigla: PHA). La PHA è una lectina estratta dalle piante (fito) che è in grado di provocare la agglutinazione dei globuli rossi. Inoltre, i linfociti stimolati dalla PHA entrano in mitosi e iniziano a dividersi.
A questo punto viene aggiunta la colchicina, un composto tossico vegetale che si comporta come un veleno per i microtubuli, bloccandone l'azione. La mitosi quindi viene bloccata in tutte le cellule allo stadio di metafase, con 46 cromosomi ben spiralizzati, tutti composti da due cromatidi e allineati sul piano centrale della cellula ("equatore"), perché i microtubuli non riescono più a separare e a trascinare i cromatidi, con la conseguente impossibilità di iniziare l'anafase.
Rimane ora il problema di allontanare tra loro i cromosomi, in quanto seppure ben visibili al microscopio risultano affollati nella stessa regione e sono quindi difficili da osservare e contare. Per questo le cellule vengono immerse in una soluzione ipotonica, cioè a minor concentrazione salina di quella presente all'interno del citoplasma. Poiché i sali non hanno passaggio libero attraverso le complesse e selettive membrane cellulari, sarà l'acqua a spostarsi verso l'interno delle cellule, per permettere il raggiungimento di un equilibrio tra la concentrazione salina all'esterno della cellula e la concentrazione salina, più elevata, presente all'interno delle cellule; questo fenomeno è detto "osmosi". In definitiva, le cellule assorbono acqua, sino a gonfiarsi e poi scoppiare. Si noti che se al contrario la soluzione fosse stata ipertonica, la cellula avrebbe perso acqua, raggrinzendosi.

La rottura della cellula causa lo spargimento nei dintorni dei cromosomi. Ora è possibile osservarli su un vetrino al microscopio, e fotografarli. Dalla foto di un gruppo di cromosomi vengono ritagliate le sagome di ciascun cromosoma, e in questo modo è possibile disporre l'immagine di ogni cromosoma ordinatamente su un foglio di carta, eseguendo una sorta di collage. I cromosomi vengono disposti in ordine decrescente rispetto alle dimensioni, dal più grande al più piccolo, e si ha cura di mettere vicini, a coppie, i due cromosomi omologhi. Al termine, potremo osservare che sono presenti 22 coppie di cromosomi omologhi, numerate da 1 a 22, per un totale di 44 cromosomi (ad es.: due cromosomi 1, due cromosomi 2, due cromosomi 3, e così via fino a 22; ciascun cromosoma è composto di due cromatidi perché non abbiamo permesso l'ultimazione della mitosi). Si noti che in effetti il cromosoma più piccolo è il 21, non il 22, per un errore iniziale nella valutazione delle dimensioni degli autosomi.

I due rimanenti cromosomi formano una coppia solo nella donna, mentre nell'uomo sono molto diversi tra loro, essendo uno molto più piccolo dell'altro. Per questa ragione sono detti "cromosomi del sesso" o "eterocromosomi" (da "etero", diverso), mentre i cromosomi non sessuali sono detti "autosomi" (da "autos", uguale, perché sono tutti presenti in coppie composte da due elementi simili tra loro). I cromosomi del sesso sono di due tipi, detti "X" e "Y" per la somiglianza della loro forma a queste due lettere dell'alfabeto. Il cromosoma X è piuttosto grande, di dimensioni simili a quelle del cromosoma 6, mentre il cromosoma Y è molto piccolo e contiene pochi geni. Il corredo cromosomico femminile comprende due cromosomi X, mentre nel cariotipo maschile si osserva un cromosoma X e un cromosoma Y.
In sintesi, il cariotipo degli individui della specie Homo sapiens si indica dichiarando il numero totale dei cromosomi, e quindi indicando, dopo una virgola, il tipo di cromosomi del sesso.
Per una donna avremo quindi:
46,XX
Per un uomo:
46,XY

La differenza genetica tra uomo e donna solo a livello dei cromosomi del sesso fa supporre, come è vero, che questi cromosomi contengano informazioni necessarie al differenziamento del sesso.

Forma dei cromosomi

Una osservazione più attenta dei cromosomi disposti ordinatamente per dimensione, come sopra indicato, permette di rilevare anche differenze di forma, dovute alla diversa posizione del centromero.
Ogni cromatide è idealmente diviso in due parti dal centromero. La regione più corta è detta "braccio corto", o "p" (dal francese "petit", piccolo), e la regione più lunga è detta "braccio lungo".  Ciascun cromosoma, essendo composto di due cromatidi, presenta quattro braccia, due corte uguali tra loro e due lunghe uguali tra loro.

Nei cromosomi "metacentrici" il centromero si trova all'incirca a metà della lunghezza dei cromatidi;
mentre in quelli "submetacentrici" si trova leggermente spostato verso una estremità.
In alcuni cromosomi, infine, il centromero è posto vicino ad una delle due estremità del cromosoma stesso; questi cromosomi, cioè le coppie 13-14-15 (gruppo D), 21-22 (gruppo G), e il cromosoma Y, sono detti "acrocentrici", dal greco "acros" (sommità), e assomigliano più a una "Y" che a una "X". I cromosomi telocentrici (con centromero in posizione terminale) non si osservano nell'uomo.
La differenza di lunghezza delle due braccia del cromatide è ovviamente particolarmente evidente nei cromosomi acrocentrici, in cui il braccio p si estende per molto poco al di là del centromero.

GRUPPI DI CROMOSOMI UMANI
http://homepages.uel.ac.uk/V.K.Sieber/human.htm

Bandeggio dei cromosomi umani

Sebbene l'osservazione delle differenze di dimensioni e di quelle di forma potrebbe essere sufficiente a stabilire l'identità di ciascun cromosoma sul cariotipo, esistono anche cromosomi diversi non facilmente distinguibili tra loro solo sulla base di questi due criteri.
Vengono quindi applicate delle colorazioni artificiali che permettono di evidenziare differenze più fini tra i cromosomi e di stabilire inequivocabilmente la coppia di appartenenza per ciascun cromosoma.
Questi coloranti tipicamente tingono solo alcune regioni del cromosoma, lasciando le altre chiare, generando così un assetto "a striscie" caratteristico di ciascuna coppia di omologhi. Queste "fasce" vengono chiamate BANDE e l'operazione di colorazione che ha il fine di ottenerle si chiama bandeggio.
La chinacrina genera bande scure dette Q (dall'inglese "Quinacrine"), mentre il colorante Giemsa evidenzia bande dette "G". Si è scoperto che le regioni che appaiono scure con questi coloranti sono ricche di basi azotate A e T, mentre le zone cromosomiche la cui sequenza presenta maggiore abbondanza di G e C rimangono non colorate.

BANDE
http://www.pathology.washington.edu/research/cytopages/spreads/human_g.gif
http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/Human_46,XY.gif
http://www.tokyo-med.ac.jp/genet/cki-e.htm

Ogni banda ha una sua nomenclatura, che permette di ricavarne la posizione, come su una mappa. Se diremo che un gene, ad es., è localizzato in 6p21.3, interpreteremo ogni dato da sinistra a destra in questo modo: cromosoma, braccio, regione, banda sottobanda. Quindi:
6   -   è il numero del cromosoma (cromosoma 6)
p   -   ci riferiamo al braccio più corto del cromosoma
2   -   il secondo gruppo di bande (regione) visibile sul braccio p, a partire dal centromero
1   -   la prima banda all'interno di questo gruppo, contando dal centromero verso il telomero
3   -   il numero preceduto da un punto indica una "sottobanda", una banda sottile visibile all'interno di una banda più spessa; in questo caso la terza sottobanda 1, sempre contata a partire dal centromero.

In altre parole, la posizione indicata è la terza sottobanda della prima banda osservabile sul secondo gruppo di bande localizzato sul braccio corto del cromosoma 6.

Per avere un punto di riferimento, si possono consultare schemi delle bande presenti in ciascun cromosoma umano, approvati a livello internazionale. Con tre tipi di tecniche diverse, si possono ottenere nell'intero cariotipo umano 400, 550 oppure 850 bande, rispettivamente. Gli "ideogrammi" sono rappresentazioni schematiche del bandeggio di ciascun cromosoma ottenibile con ciascun tipo di metodica.
La rappresentazione del corredo cromosomico come serie di cromosomi bandeggiati è detta cariogramma.

IDEOGRAMMI DEI CROMOSOMI UMANI
http://www.pathology.washington.edu/research/cytopages/idiograms/human/

Si noti che un difetto su un braccio di un cromatide di un cromosoma, è presente anche sul braccio corrispondente dell'altro cromatide, che ne è la copia. Una banda può contenere decine o centinaia di geni; la posizione del gene sul cromosoma si chiama locus (plurale: loci).

MAPPA FISICA DEI CROMOSOMI UMANI
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?chr=hum_chr.inf&query

Poichè la più piccola alterazione di un cromosoma visibile mediante l'analisi del cariotipo standard è quella di una banda o sottobanda, che in media comprende un tratto di DNA della lunghezza di 4 milioni di basi, ne consegue che le alterazioni visibili osservando il cariotipo sono quelle di grande estensione, come le mutazioni genomiche o cromosomiche, mentre mutazioni che riguardano poche basi non si potranno evidenziare con questa metodica. Metodiche più recenti permettono di ottenere risoluzioni molto superiori.

In conclusione, l'analisi del cariotipo permette di stabilire:
- la specie dell'individuo
- il sesso dell'individuo
- la presenza di eventuali alterazioni del numero e del tipo di cromosomi
- la presenza di eventuali alterazioni della struttura dei cromosomi

La divisione cellulare comporta la replicazione delle informazioni genetiche della cellula madre e la sua ridistribuzione nelle cellule figlie.

La mitosi è la divisione delle cellule somatiche, e il trattamento dell'informazione genetica è mirato semplicemente alla conservazione dell'informazione genetica nelle due cellule figlie.
Dal punto di vista genetico, riassumiamo gli aspetti informazionali di una cellula umana ("Cellula madre") che si divide generando due cellule figlie ("Cellula figlia 1" e "Cellula figlia 2"). I parametri che seguiremo sono: c ("DNA content", il contenuto in DNA, relativo a quello di una cellula aploide); il numero di cromosomi, dove n=23, numero aploide, nella specie umana; il tipo di cromosomi (composto di una sola molecola a doppia elica, ossia "monocromatidico", oppure di due doppie eliche identiche, ossia "dicromatidico", con due cromatidi fratelli); la dimensione in Gbp (miliardi di coppie di basi);
 
 

Cellula	Contenuto in DNA	Numero di cromosomi	Tipo di cromosomi	Dimensione del genoma
Cellula madre	2c	2n = 46	Monocromatidico	6,4 Gbp
Cellula madre dopo la fase S (replica del DNA)	4c	2n = 46	Dicromatidico	12,8 Gbp
Cellula figlia 1	2c	2n = 46	Monocromatidico	6,4 Gbp
Cellula figlia 2	2c	2n = 46	Monocromatidico	6,4 Gbp

Il significato genetico è quindi quello di ricostituire nelle cellule figlie la stessa informazione, qualitativa e quantitativa, della cellula madre. Se ciò fosse sempre vero, un individuo multicellulare sarebbe composto di cellule tutte geneticamente identiche al 100% tra loro. In realtà, per effetto di mutazioni puntiformi originatesi durante la replicazione del DNA e sfuggite ai sistemi di riparazione, si stima che circa 10^-9 basi per genoma siano diverse (6 basi in ogni cellula), con un accumulo progressivo ad ogni mitosi, per cui le cellule somatiche dell'adulto possono avere alcune decine di geni mutati rispetto a quelli presenti nello zigote, tollerati perché non influenti sulle funzioni dello specifico tipo cellulare differenziato.

La meiosi è la divisione cellulare tipica delle cellule germinali negli individui a riproduzione sessuata, e presenta due particolarissimi fenomeni nel trattamento delle informazioni: il dimezzamento del genoma, e la generazione di nuove sequenze cromosomiche rispetto a quelle originarie.
Il dimezzamento del numero dei cromosomi nella cellula sessuale matura  (gamete) permette di mantenere costante tale numero nella specie, in quanto in seguito a unione dei gameti dei due sessi, entrambi con numero aploide di cromosomi, si ricostituisce il doppio corredo cromosomico (diploide) tipico delle cellule somatiche, che possiedono una versione paterna e una materna di ciascun cromosoma. La riduzione del materiale genetico avviene in due fasi: nella prima divisione cellulare (meiosi I) il precursore dei gameti replica il DNA, ma durante la divisione cellulare i cromatidi non si separano, per cui ciascuna cellula riceve 23 cromosomi dicromatidici, ossia un solo cromosoma per ciascuna coppia di omologhi. Segue una seconda divisione cellulare (meiosi II) non preceduta da replicazione del DNA, durante la quale i due cromatidi dei 23 cromosomi di ciascuna cellula si separano, ottenendosi alla fine due cellule figlie (da ciascuna delle cellule prodotte dalla meiosi I) con 23 cromosomi monocromatidici, patrimonio che corrisponde al 50% di quello delle cellule somatiche.
 
 
 

Cellula	Contenuto in DNA	Numero di cromosomi	Tipo di cromosomi	Dimensione del genoma
Spermatogonio	2c	2n = 46	Monocromatidico	6,4 Gbp
Spermatocita di I ordine dopo la fase S  (replicazione del DNA)	4c	2n = 46	Dicromatidico	12,8 Gbp
Meiosi I
Spermatocita II ordine (prima cellula figlia)	2c	n = 23	Dicromatidico	6,4 Gbp
Spermatocita II ordine (seconda cellula figlia)	2c	n = 23	Dicromatidico	6,4 Gbp
Meiosi II
Spermatide (prima cellula figlia)	c	n = 23	Monocromatidico	3,2 Gbp
Spermatide (seconda cellula figlia)	c	n = 23	Monocromatidico	3,2 Gbp

Inoltre, il dimezzamento del materiale genetico è associato anche alla prima fonte di variabilità della informazione genetica nei gameti: l'assortimento indipendente, ossia la distribuzione casuale di ciascun membro di una coppia di cromosomi omologhi in una delle due cellule figlie all'atto della anafase I. Ad esempio, prendendo in esame la coppia di cromosomi 1, il cromosoma 1 paterno potrebbe segregare nella cellula figlia 1, e il corrispettivo materno nella cellula figlia 2; il contrario potrebbe avvenire casualmente per la coppia dei cromosomi 2, e così via. Se si considerano in H. sapiens le 23 coppie dei cromosomi, i membri di ciascuna delle quali vengono distribuiti a caso tra le due cellule figlie, si hanno 2²³ combinazioni possibili, ossia più di 8 milioni di gameti diversi solo per effetto dell'assortimento indipendente durante il dimezzamento del genoma.

Sebbene tale variabilità sia di per sé enorme, va anche sottolineato che durante la meiosi I, durante la profase, i rispettivi cromosomi dicromatidici omologhi si sovrappongono (appaiamento degli omologhi), e vanno incontro al crossing-over, un meccanismo per cui due dei cromatidi sovrapposti vengono tagliati, e i segmenti generati dal taglio su ciascun cromatide si scambiano la posizione, finendo per trovarsi sull'altro membro della copia di cromosomi. In questo modo, si formano due nuove doppie eliche, ciascuna composta di una parte di origine paterna e una parte di origine materna. Il processo può essere immaginato come la creazione di nuovo mazzo di carte (i geni) a partire da due mazzi originariamente omogenei, o come l'assemblaggio di un nuovo programma mescolando le istruzioni di due programmi originari. Poiché il numero di punti di scambio e la loro posizione sono casuali, il numero possibile di nuove sequenze di DNA che ciascuna coppia di cromosomi appaiati può generare dopo il crossing-over è inconcepibilmente alto, ed è praticamente impossibile che una singola cellula sessuale di un individuo ripeta la stessa configurazione di crossing-over per tutte e 23 le coppie di cromosomi che si è verificata in un'altra cellula.

Nella specie umana, il numero di scambi per ogni cellula in cui avviene il crossing over è in media di 27  nel maschio (intervallo: 17-37, deviazione standard: ±7) e di 42 nella femmina  (intervallo: 28-61, deviazione standard: ±4). Nella gametogenesi femminile si ha quindi costantemente un maggior tasso di crossing-over, per ragioni non chiare.

è importante notare come l'avvenimento di almeno uno scambio per ciascuna coppia di cromosomi omologhi sembri essere fondamentale per la realizzazione di una meiosi corretta: l'assenza di crossing over favorisce una segregazione anomala dei due cromosomi appaiati, che possono non separarsi dando origine a mutazioni cromosomiche di numero (una cellula riceve entrambi i cromosomi omologhi, e l'altra nessuno).

La fecondazione segna l'inizio di un nuovo organismo, ed è il processo per cui due cellule germinali si fondono insieme per creare un nuovo individuo con un programma genetico derivato da entrambi i genitori. Alla fecondazione, una ulteriore (terza) fonte di variabilità genetica è generata dall'unione casuale di uno dei gameti paterni con uno dei gameti materni. In un episodio di fecondazione umana, sono in gioco circa 150 milioni di gameti maschili (spermatozoi) e uno tra i circa 400.000 gameti femminili (ovociti).
Se il significato genetico della fecondazione è quello della ricostituzione di un programma genetico completo, in grado di dirigere lo sviluppo del nuovo individuo, si pone il problema della corretezza dei due singoli programmi genetici generati dai processi precedenti, e anche quello della compatibilità tra di due programmi stessi, perché specifiche combinazioni di alleli paterni e materni potrebbero non essere compatibili con uno sviluppo normale. Il controllo della qualità dei programmi genetici è affidato a meccanismi biologici di selezione naturale: gameti che portano gravi mutazioni non sopravvivono,  o sono svantaggiati durante la competizione per il processo di fecondazione. Inoltre, se lo squilibrio si forma solo nello zigote (o "one-cell embryo"), ed è grave, l'embrione può andare incontro ad aborto spontaneo.

In sintesi, i programmi genetici di ciascun genitore vengono dimezzati, rimescolati (mediante il crossing -over e l'assortimento casuale) e riuniti nella nuova cellula che si forma in seguito alla fecondazione. è quindi al momento della selezione del nuovo programma genetico, che avviene al momento dell'ingresso di quel determinato spermatozoo in un particolare ovocita, che risultano stabilite le caratteristiche ereditarie individuali.

Cromosomi, Mitosi e Meiosi:
I video sono in formato .mov (Quick Time e compatibili)

http://www.whfreeman.com/lodish4e/con_index.htm?09 (fare click su "Animations" e poi su "Three-Dimensional Packing of Nuclear Chromosomes")

http://academy.d20.co.edu/kadets/lundberg/DNA_animations/mitosis.mov

http://academy.d20.co.edu/kadets/lundberg/DNA_animations/mitosis1.mov

http://www.bio.davidson.edu/misc/movies/MEIOSIS.MOV